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ByFast系列快速内切酶是一系列经过基因工程重组、能够在5～15分钟内仅使用一种缓冲液就能快速完成DNA酶切的高品质限制性内切酶。ByFast系列快速内切酶适用于质粒DNA、PCR产物或基因组DNA等的快速酶切。

• 在5～15分钟内就能完成酶切。
  
• 所有ByFast系列内切酶共用一种酶切缓冲液CutSharp Buffer，大大简化酶切反应体系，方便进行双酶切或多酶切。
  
• 针对不同酶在CutSharp Buffer中活性存在差异的问题，调整了不同酶的浓度，可以统一按照每20μL体系加入1μL酶量的用量进行酶切反应。
  
• 碱性磷酸酶、南极磷酸酶、T4 DNA Ligase、T4多聚核苷酸激酶、T4 PNK (3'phosphatase minus)等很多修饰酶等都100%兼容CutSharp Buffer，使“酶切-连接”和“酶切-修饰-连接”等反应体系可以兼容，支持一管化反应。
  
• 良好的酶活冗余度，轻松应对底物过量或困难模板酶切。

• 酶活性检测：最适反应温度下，在20μL反应体系中，1μL NsiI能够在15min内完全消化1μg λDNA。
  
• 长时间酶切检测：最适反应温度下，将1μL NsiI与1μg λDNA共同温育3h，未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解，延时酶切可能出现星号活性。
  
• 酶切-连接-再酶切检测：最适反应温度下，使用1μL NsiI消化底物，回收酶切产物，在22℃下使用适量T4 DNA Ligase可以将酶切产物重新连接，将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开连接产物。
  
• 非特异性内切酶活性检测：最适反应温度下，将1μL NsiI与1μg超螺旋质粒DNA共同温育4h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，质粒DNA仍然处于超螺旋状态。
  
• 蓝白斑检测：将含有单一lacZα基因的载体以1μL NsiI消化，重新连接后转化入大肠杆菌感受态细胞，涂布在含有对应抗生素、IPTG和X-gal的LB培养基平板上。连接正确的产物会生长出蓝色菌落，而连接错误(即DNA末端切口不完整)的产物将得到白色菌落。对于ByFast系列限制酶而言，白色菌落比例应小于1%。

• 内切酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。
  
• 不含核酸酶的超纯水推荐选购百奥莱博的无菌无酶超纯水(货号：YT998)。
  
• 如果发现预期的酶切位点不能切开，请确认是否存在甲基化干扰问题。
  
• 同裂酶对于不同的甲基化修饰可能具有不同敏感性，遇到可能存在甲基化干扰问题时，可以尝试同裂酶。
  
• ByFast NsiI快速内切酶在不同反应缓冲液中的活性(缓冲液兼容性)如下：

  CutSharp	LoadEasy CutSharp	Thermo FastDigest	NEB CutSmart	Takara QuickCut
  100%	100%	100%	100%	100%

• ByFast NsiI快速内切酶识别位点的甲基化影响请参考下表：

  Dam	Dcm	CpG	EcoKI	EcoBI
  无影响	无影响	无影响	无影响	序列重叠时可能影响剪切

• 单酶切时可以参考如下反应体系，在冰浴上进行操作。
  

  成分	质粒DNA	PCR产物	基因组DNA
  超纯水	(17-x)μL	(26-x)μL	(40-x)μL
  10×CutSharp Buffer	2μL	3μL	5μL
  底物DNA	xμL(≤1μg)	xμL(~0.2μg)	xμL(5μg)
  NsiI内切酶	1μL	1μL	5μL
  总体积	20μL	30μL	50μL
  37℃温育	15min	15～30min	30～60min

  
  注：上述反应体系适用于经过纯化的PCR产物酶切。未纯化的PCR产物有一定的离子强度和pH，10×CutSharp Buffer加入量可适当减少至2μL。但由于很多DNA聚合酶同时具有外切酶活性，会影响酶切产物，因此如下一步需进行连接、克隆等操作，建议酶切前对PCR产物进行纯化。
  
  • 参考上表依次加入各种液体后，用移液器轻柔吸打或轻弹管壁以混匀(切勿涡旋混合)，然后瞬时离心以沉降液体至管底。
    
  • 37℃温育15min (质粒)，或15～30min (PCR产物)，或30～60min (基因组DNA)。酶切反应时优先推荐使用水浴，反应温度通常更加恒定一些。
    
  • 80℃温育20min即可使酶失活并停止反应(可选)。
• 双或多酶切时可以在参考上表单酶切反应体系设置的基础上，参考如下原则设置反应体系。
  
  • 每种快速内切酶的用量为1μL，并根据需要适当扩大反应体系；
    
  • 所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的1/10；
    
  • 如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同，应先从最适温度低的酶开始酶切，再添加最适温度较高的酶，在其最适反应温度下进行酶切反应。